ELISA常见样本处理及保存

灵九儿

用于ELISA实验的样本有多种类型，包括血清和血浆、细胞培养上清、尿液以及组织匀浆等。不同样本类型的预处理方法存在差异。合适的样本预处理，是确保ELISA实验准确性的第一步。这里，小E介绍几种不同样本类型的处理方法：
常规样本处理方式

血液样本
血液样本分为全血、血浆、血清三种。简单描述：

全血：全血=血浆+血细胞。
血浆：全血加抗凝剂后离心分离出来的淡黄色液体是血浆。
血清：全血不加抗凝剂而自然凝固后分离出来的，不含纤维蛋白原的淡黄色液体是血清。

血液样本是ELISA/液相实验最常用的样本。在收集血液样本的过程中应避免溶血，因为红细胞在溶解时会释放具有过氧化物酶活性的物质，将会出现非特异性显色反应，导致检测结果不准确，出现假阳性结果。另外，样本还需要避免细菌污染，因为其可能会导致样本含有内源性HRP，也会导致检测结果不准确。且要避免使用高血脂样本。脂质会影响抗原抗体的结合，从而影响测值的准确性。
1.血清和血浆

血清是ELISA实验最常用的样本，其预处理也十分简单。

• ① 使用无热原、无内毒素的试管或离心管采集血液样本，将试管或离心管在室温下放置1小时或2-8℃过夜，分离出血清；
  
• ② 2-8℃条件下，以1000×g离心20分钟，小心收集上层血清。
  

血浆样本

• ① 使用含抗凝剂的采血管或离心管采集血液样本，采集后30分钟内，2-8℃条件下，以1000×g离心15分钟，小心收集上层血浆；
  
• ② 常见的抗凝剂包括：EDTA钠盐，肝素钠，枸橼酸钠等。
  

2.细胞培养上清

将细胞培养上清液吸入离心管中，在2-8℃条件下，以1000×g离心20分钟，除去细胞碎片和杂质，收集上清液。
3.细胞裂解液

• ① 吸出培养板中的培养基，用胰蛋白酶消化细胞，再加入适量的培养基，将培养板上的细胞冲洗干净（悬浮细胞可以省略该步骤）；
  
• ② 将细胞悬浮液收集到离心管中，在2-8℃条件下，以1000×g离心5分钟，再吸去培养基，用预冷PBS洗涤细胞3次；
  
• ③ 加入适量的预冷PBS（建议在使用前立即加入蛋白酶抑制剂），重悬细胞。添加比例：约1×106个细胞加入150-250μL PBS重悬细胞；
  
• ④ 使样本在-20℃或-80℃条件和室温条件下反复冻融，重复冻融过程数次，直至细胞完全裂解。也可使用超声波细胞破碎器，超声处理悬浮液来裂解细胞；
  
• ⑤ 2-8℃条件下，以1500×g离心10分钟，去除细胞碎片，收集上清液。
  

4.组织匀浆

• ① 用预冷的PBS（0.01M，PH7.4）冲洗组织，除去表面残留的血液或杂质；
  
• ② 将组织块称重，再切成尽可能小的碎块，以便充分匀浆；
  
• ③ 加入适量的预冷PBS（一般按1:9的重量体积比，比如1g组织样品对应9mL PBS，具体体积可根据实验需要适当调整，并做好记录。推荐在PBS中加入蛋白酶抑制剂），用玻璃匀浆器在冰上或冰浴中充分匀浆。为了进一步裂解组织细胞，可以对匀浆液进行超声破碎，或反复冻融；
  
• ④ 将匀浆液吸入离心管中，2-8℃条件下，以5000×g离心5分钟，收集上清液。
  

5.脑脊液

• 根据实验要求，取适量上清液进行实验测定。
  
• 大鼠脑脊液采集方法：采集脑脊液时，用湿纱布擦试大鼠颈背部皮肤，剪去背毛暴露皮肤。两耳连线剪一横切口(1.5cm 左右)，在其中点向尾侧沿皮下剪开 2cm，将皮分离两侧，扩大视野。紧贴大鼠头 骨依次逐层剪切各肌层，并断端依次拉向尾侧扩大视野。注意，有出血时用干纱 布按压止血，保持术口清晰。接近颈后黄韧带时，小心地用 7 号注射针头分离覆 盖的肌肉，暴露寰枕膜。用 1ml 注射器(针头用止血钳使针尖与针体成 150 度钝 角)，针斜面向上，针尖端近水平刺入蛛网膜下腔，固定针体，缓慢抽取脑脊液， 一般采集量为 100-200 微升。
  

6.肺泡灌洗液

• ①　10%水合氯醛溶液，麻醉腹腔。打开腹腔，另取10mL注射器进行下腔静脉采血，尽可能将血放尽。
  
• ②　在冰面上对肺进行肺灌洗。取37℃生理盐水5mL，分三次灌洗：2mL、1.5mL、1.5mL灌洗，回收率在70%以上。
  
• ③　使用无菌管收集肺泡灌洗液后1000xg离心10min，离心后收集上清，并将标本保存于-20℃或-80℃，且应避免反复冻融，如有沉淀形成，应再次离心。
  

样本保存方法

样品收集后，若在1周内进行检测，可保存于2-8℃的环境中；若不能及时检测，请按一次使用量分装，冻存于-20℃（1个月内检测）或-80℃（3个月内检测）的环境中，避免反复冻融。实验前，建议再次离心，去除沉淀物。
注意事项

• 试剂盒的检测范围不等同于样本的浓度范围。如果样品中检测物浓度高于标准品的最高值，请根据实际情况，做适当倍数稀释（建议查阅文献，并做预实验）。
  
• 收集组织与细胞提取液样本时，不建议使用商品化的裂解试剂。裂解试剂中的成分，可能会影响抗原抗体结合，或造成基质干扰，最终影响实验结果。
  

胡来财

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牛善和

LZ敢整点更有创意的不？兄弟们等着围观捏~

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LZ帖子不给力，勉强给回复下吧

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锄禾日当午，发帖真辛苦。谁知坛中餐，帖帖皆辛苦！