小鼠单细胞转录组数据之PRJNA604055

肥祥

在  https://www.ncbi.nlm.nih.gov/sra/?term=PRJNA604055 可以看到这个数据集来源于文章：《Single-nucleus RNA-seq of mice arcuate nucleus of hypothalamus after pro-longed high fat diet》，就6个样品：
安装conda

这里推荐每个人安装自己的conda，这样的话一个服务器里面的每个用户独立操作，安装方法代码如下：
# 首先下载文件，20M/S的话需要几秒钟即可
wget https://repo.anaconda.com/miniconda/Miniconda3-latest-Linux-x86_64.sh
# 接下来使用bash命令来运行我们下载的文件，记得是一路yes下去
bash Miniconda3-latest-Linux-x86_64.sh
#  安装成功后需要更新系统环境变量文件
source ~/.bashrc安装好conda后需要设置镜像（取决于你服务器的情况，部分网络比较好的服务器可以不设置镜像）
conda config --add channels https://mirrors.bfsu.edu.cn/anaconda/cloud/bioconda/
conda config --add channels https://mirrors.bfsu.edu.cn/anaconda/cloud/conda-forge/
conda config --add channels https://mirrors.bfsu.edu.cn/anaconda/pkgs/free/
conda config --add channels https://mirrors.bfsu.edu.cn/anaconda/pkgs/main/
conda config --set show_channel_urls yes一个完整并且好用的conda真的是生产力工具。接下来就使用conda来配置mamba后设置kingfisher环境。
配置mamba后设置kingfisher环境

七八年前我写教程，尤其是多组学测序数据分析，都是从ncbi的sra数据库里面下载sra文件，然后一步步处理。很多教程还录制成为了视频上传到b站。但是读者多了之后我接受到的大家的反馈就是从ncbi的sra数据库里面下载sra文件实在是太慢了，因为我做演示的服务器在境外，所以自己压根就没有意识到这点。但是陆陆续续有小伙伴告诉我应该是使用aspera从ebi的ena数据库直接下载fastq文件即可，高速而且还少了一个sra文件转为fastq的步骤。所以后来我也开始在日常更新的公众号里面推荐这个方法，就是参考：使用ebi数据库直接下载fastq测序数据  , 需要自行配置好。但是风水轮流转，没想到，也没有过去多少年，就风水轮流转， aspera从ebi的ena数据库这个手段时灵时不灵的。现在只能是回归sra下载，见：转录组上游定量分析其实真不难，4步可定（一），从ncbi的sra数据库里面下载sra文件需要的是sra-tools这个工具套件， 如果你按照我的转录组流程配置：在全新服务器配置转录组测序数据处理环境，会发现安装的是sra-tools-2.8.0 ，后面仍然是报错，所以得指定版本，比如从github安装最新版。
慢慢的，大家在交流群提到了无论是使用sra-tools从ncbi的sra数据库里面下载sra文件，还是使用aspera从ebi的ena数据库直接下载fastq文件，都是得费劲测试和验证， 还得自己准备每个项目的全部的样品的信息，工作繁琐。所以就有了kingfisher，仅仅是需要一个项目ID，就可以自动去检索ebi的ena数据库和ncbi的sra数据库，自动合适的方式下载，非常方便。
代码如下所示：
conda install mamba
mamba init
mamba list

mamba create -n kingfisher python=3.8
mamba activate kingfisher
mamba install -c bioconda kingfisher


conda create -n kingfisher python=3.8
conda activate kingfisher
conda install -c bioconda kingfisher一行代码下载数据

kingfisher get -p PRJNA604055  -m ena-ascp ena-ftp prefetch aws-http第二天打开服务器看看，这6个10x技术单细胞样品的fq文件总共是157G的压缩后的fq文件：
ls -lh |cut -d" " -f 5-

5.6G 1月  20 11:39 SRR10992871_1.fastq.gz
21G 1月  20 12:25 SRR10992871_2.fastq.gz
5.9G 1月  20 12:36 SRR10992872_1.fastq.gz
22G 1月  20 12:59 SRR10992872_2.fastq.gz
5.8G 1月  20 13:06 SRR10992873_1.fastq.gz
22G 1月  20 13:32 SRR10992873_2.fastq.gz
5.5G 1月  20 13:39 SRR10992874_1.fastq.gz
20G 1月  20 14:06 SRR10992874_2.fastq.gz
5.8G 1月  20 14:12 SRR10992875_1.fastq.gz
22G 1月  20 14:34 SRR10992875_2.fastq.gz
5.4G 1月  20 14:38 SRR10992876_1.fastq.gz
20G 1月  20 14:51 SRR10992876_2.fastq.gz如果你熟悉10x单细胞转录组数据，就知道：

• 首先，1-26个cycle就是测序得到了26个碱基，先是16个Barcode碱基，然后是10个UMI碱基；通常是R1文件
  
• 然后，27-34这8个cycle得到了8个碱基，就是i7的sample index；通常是I1文件
  
• 最后35-132个cycle得到了98个碱基，就是转录本reads（目前很多测序仪都是150bp了），通常是R2文件
  

也就是说R2 文件是真正的测序reads，肯定是文件最大。
所以把上面的样品名字进行合适修改后就可以走cellranger的定量流程。
cellranger的定量流程详解：

正常走cellranger的定量流程即可，代码我已经是多次分享了。参考：

• 10X单细胞转录组原始测序数据的Cell Ranger流程（仅需800元）
  
• 10X的单细胞转录组原始数据也可以在EBI下载
  
• 一个10x单细胞转录组项目从fastq到细胞亚群
  
• 一文打通单细胞上游：从软件部署到上游分析
  
• PRJNA713302这个10x单细胞fastq实战
  
• 一次曲折且昂贵的单细胞公共数据获取与上游处理
  
• 只能下载bam文件的10x单细胞转录组项目数据处理
  
• 不知道10x单细胞转录组样品和fastq文件的对应关系
  
• 10X单细胞转录组测序数据的 SRA转fastq踩坑那些事
  
• 10x的单细胞转录组fastq文件的R1和R2不能弄混哦
  

差不多几个小时就可以完成全部的样品的cellranger的定量流程。基础知识非常重要，我们在单细胞天地多次分享过cellranger流程的笔记（2019年5月），大家可以自行前往学习，如下：

• 单细胞实战(一)数据下载
  
• 单细胞实战(二) cell ranger使用前注意事项
  
• 单细胞实战(三) Cell Ranger使用初探
  
• 单细胞实战(四) Cell Ranger流程概览
  
• 单细胞实战(五) 理解cellranger count的结果
  

牛善和

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冬天收获

占坑编辑ing

用户天行剑

呵呵。。。

八十克的波

报告！别开枪，我就是路过来看看的。。。

对影成双

LZ敢整点更有创意的不？兄弟们等着围观捏~

马小东

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施月强

支持楼主，用户楼主，楼主英明呀！！！

水公子

顶顶更健康

一杯老酒

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