第六课：拟永生化产后耳蜗组细胞产生足量细胞系且具有调控 ...

落叶的孤寂

研究背景

听觉毛细胞(HC)是耳蜗中机械感应细胞对听力具有至关重要的作用。毛细胞是高度分化且丰度较低的一类细胞，每个小鼠耳蜗仅有3300个毛细胞。毛细胞分为内毛细胞(IHC)和外毛细胞(OHC)。OHC是电动的而且起耳蜗放大器的作用。然而OHC的电动性由prestin蛋白决定。但是，关于prestin蛋白的调控却研究较少，主要原因在于缺乏合适研究prestin的系统。

虽然，可以通过“immorto-mouse”产生毛细胞的细胞系，但是这类细胞在表型上与原代的毛细胞还是存在着明显的表型差异。因此，作者利用报道的体外重编程培养技术(CR)培养耳祖细胞(CR-OSCs)并对其进行相关的鉴定和研究，发现其能够有效表达分化后的毛细胞相关标识物，特别是终端分化的基因prestin。
实验数据

一、条件性重编程代系限制的耳干细胞
前期的研究是通过条件性重编程培养乳腺和包皮细胞，作者猜想可以利用该条件性重编程技术来培养柯蒂氏器(听觉感受器)。作者从小鼠体内分离耳部表皮细胞进行条件性重编程培养，发现培养7天后，基底细胞上形成鲜明的细胞群落(图1A和B)。为了能够区分基底细胞和培养的细胞克隆，作者从Rosa26-CAG-TdTomato小鼠里分离出耳部细胞，并且通过免疫荧光可以观察到细胞群落都是红色的克隆(图1C)，由此可见形成的细胞群落来自培养的细胞而非基底细胞。此外，作者研究其他的细胞是否也可以充当基底细胞的作用，按照条件性重编程培养的方法，作者将丝裂霉素处理的NIH3T3和MEF细胞作为基底细胞，并添加Rock抑制剂，培养小鼠耳表皮细胞。虽然也有部分细胞群落形成，但是生成速度慢而且经过第二次传代后没有新的细胞克隆生长(图1D和E)。


二、条件性重编程耳干细胞的分析
作者进一步分析了条件性重编程的耳干细胞的特性。首先，作者通过连续10代传代培养，发现，细胞数是成线性增长的(图2A)。其次，作者论证条件性培养的细胞增殖会不会随代数改变。通过比较不同代数细胞增殖产生的细胞数，作者发现虽然细胞数有波动，但是整体保持相对稳定(图2B)。再者，细胞获得维持稳定的增殖需要保持其端粒酶的活性，因此通过检测条件性重编程细胞的端粒酶的活性发现细胞培养7天后(第二代后)细胞的端粒酶的活性明显上调(图2C)。最后，作者通过比较条件性重编程培养和体外耳表皮细胞培养，发现七天后两种培养条件细胞数相似，说明条件性重编程整体激活了耳细胞的增殖能力(图2D)。


三、条件性重编程的耳干细胞在分化条件下上调毛细胞特异性基因
将条件性重编程的耳干细胞在分化条件下，作者研究其毛细胞分化的表面分子标志物，发现高表达Myo6(图3A)。其次，研究这类细胞是否分化产生Prestin，作者将YFP-Prestin小鼠细胞进行相同出发，发现条件性重编程后的细胞在分化条件下也能产生Prestin(图3B)。当共同染色Myo6和Prestin时，作者发现所有Prestin阳性的细胞都是Myo6。因此，作者推测Myo6阳性细胞中存在部分细胞分化产生Prestin阳性的细胞(图3C)。
为了更好的定性研究毛细胞分化的表面分子标志物，做利用定量PCR检测了Atoh1, Pou4f3, Myosin 6, Myosin 7a, Parvalbumin, Otoferlin, VGlut3, Prestin。作者发现在这些分子在培养的第1代和第14代都有表达，并且其中Atoh1， Pou4f3， Myosin6， Myosin7a， Parvalbumin， Prestin的表达在第14代显著提高。


四、细胞代数对CR-OSCs细胞在分化条件性下转录的影响
本篇前期的结果已经证明，耳干细胞能够在体外进行条件性重编程培养，且能够进行重复传代。因此，作者研究在不同代数中，毛细胞的表面分子的变化(图4)。作者发现除了Myosin 7a和Myosin 6在培养的第1代和第5代有显著下调(图4C和D)，其他的分子维持相对稳定(图4A-B，E-H)。


五、过表达Atoh1后CR-OSC能够上调Pou4f3, Myosin VI和 Otoferlin
研究表明，Atoh1能够上调毛细胞特异性的基因，并且驱使未成熟的毛细胞分化。因此，作者利用AAV载体过表达Atoh1研究其对耳干细胞的影响。其中HEI-OC1能够表达部分毛细胞表明标识物的耳细胞系，HEK是人的肾上皮细胞作为阴性对照。发现过表达Atoh1能够诱导Pou4f3和Myosin6以及Otoferlin的表达(图5)。并且与之前的研究一致，过表达Atoh1不能够诱导Prestin的表达(图5G)。


六、甲状腺激素处理能够诱导CR-OSC上调Prestin
甲状腺激素能够诱导Prestin的表达。甲状腺激素有三种类型，其中包括四碘甲腺原氨酸(T4)和三碘甲腺原氨酸(T3)。作者分别使用T4和T3处理条件性重编程的耳干细胞，利用qPCR检测Prestin的表达(图5)。作者发现条件性重编程的耳干细胞能够诱导Prestin的表达，但是HEI-OC1和HEK细胞系则不行。因此，条件性重编程的耳干细胞(CR-OSC)和外耳毛细胞(OHC)具有相似的特性，能在甲状腺激素处理后上调Prestin的表达。


总结与讨论

通过尝试体外条件性重编程培养，作者建立了体外扩增耳干细胞的。该系统能够非常高效的体外扩增耳干细胞。其优势主要集中以下三点：
第一，由一只耳蜗能产生数量庞大的细胞。
第二，培养体系简单。任何实验室都有望建立并使用。
第三，该培养体系是瞬时的且不改变细胞的基因组。
第四，利用不同的遗传学修饰的小鼠获得不同的条件性重编程耳干细胞。

三高营养顾问

小短腿的黑猫

沙发？？？

马志得

帮你煲鱼头汤

好，很好，非常好！

墙角看世界

向楼主学习

冰心依旧

楼猪V5啊

聊爷名场面

我只是路过，不发表意见

琴儿在睡觉

LZ敢整点更有创意的不？兄弟们等着围观捏~

菲儿正品商城

支持你哈...................................